Процессинг

Процессинг

Теперь подробно рассмотрим техническое исполнение приготовления срезов по Mohs (процессинг).

Денуклеация

Удаление центрально расположенной основной массы опухоли - Денуклеация (Debulking). Удаленный лоскут выкладываем на лист ровного картона. Сразу же соответственно насечкам на лоскуте рисуем штрихи на картоне, обозначаем точкой дистальный край. После этого лоскут относительно картона не смещаем, при всех манипуляциях поворачиваем весь лист картона вместе с лоскутом.

Маркером прорисованы видимая граница опухоли и граница резекции с насечками:

Иссеченный лоскут помещен на лист картона, хорошо видны насечки на лоскуте и крае ране. Отмечается соответствие ориентации лоскута ране:

Очень острым(!) скальпелем, отступя от периферического края 1,5-2 мм, тангенциально срезаем основную массу опухоли. Очень важно при этом не перфорировать лоскут насквозь, так как при этом повреждается глубокая поверхность, и через образовавшиеся дырки может выпадать опухоль, приводя к ложно-положительным результатам гистологической оценки глубокого края. В зависимости от толщины удаленного лоскута денуклеация выполняется либо вдоль глубоких слоев дермы (если лоскут тонкий), либо субдермально (если лоскут содержит достаточный подкожный или мышечный слой).

Вид иссеченного кожного лоскута с опухолью в центре

Иссечена расположенная в центре основная масса опухоли. Важно отметить, что отсутствуют сквозные повреждения дна лоскута. Периферический край приблизился к плоскости глубокого края резекции.

Удаленная центральная часть лоскута отправляется на классическое гистологическое исследование для верификации морфологии опухоли. Иногда имеет смысл из удаленной массы опухоли взять небольшой кусочек и приготовить с него криосрезы. Это дает представление о морфологии конкретной опухоли и является полезным при оценке срезов периферического и глубокого края. Таким образом, этап денуклеации выполняет две задачи:

1

Оценить морфологию опухоли классическим гистологическим исследованием;
2

Получить начальное расслабление лоскута, чтобы перевести полусферу поверхности резекции (периферический край и глубокая поверхность) в одну плоскость.

Этап этот, как, впрочем, и все остальные, выполняется предельно осторожно и аккуратно!

Релаксация лоскута

Релаксация лоскута.После этапа debulking уже достигается определенная релаксация лоскута и уплощение полусферы «глубокая поверхность - периферический край». В идеале же нам нужно, чтобы эта полусфера превратилась в одну плоскость, с которой мы сможем получить криосрезы. То есть мы должны добиться, чтобы весь периферический край (срез эпидермиса и дермы) вместе с глубокой поверхностью полностью прилегал к плоскости листа картона. Для этого выполняем множество радиальных и концентрических надрезов. Важное требование: надрезы не должны быть сквозными. По той же причине: через сквозные разрезы может выпадать опухоль, приводя к ложно-положительным результатам.
Конечная цель этапа релаксации: эпидермо-дермальный край резекции по всей окружности должен быть распластан на плоскости картона, и при боковом взгляде край эпидермиса по линии резекции должен на всех 360° окружности прилегать к листу картона.

Конечная цель этапа релаксации: эпидермо-дермальный край резекции по всей окружности должен быть распластан на плоскости картона, и при боковом взгляде край эпидермиса по линии резекции должен на всех 360° окружности прилегать к листу картона.

Вид сбоку на резецированный лоскут в конце этапа релаксации. Хорошо видны радиальные несквозные насечки. Весь эпидермальный и дермальный край резекции стал лежать в единой плоскости с глубоким краем резекции:

Вид сверху. На левой половине хорошо видны перпендикулярно расположенные (радиальные и концентрические) несквозные насечки. Радиальные несквозные насечки видны также на дерме. В результате получена достаточная релаксация, чтобы весь периферический и глубокий края стали располагаться в одной плоскости:

Сохранять лоскут цельным или исследовать по частям? Существуют разные подходы:

1

Исследовать цельный лоскут
– технически методика несколько сложнее, особенно на этапе криотомии. Но зато гистологическая картинка тоже получается цельной, позволяет легче определять расположение остатков опухоли.
2

Делить лоскут на части и исследовать каждую часть отдельно.
Криосрезы выполняются с более мелкого материала. Соответственно – технически проще.

Оба подхода имеют право на жизнь. И при тщательном техническом исполнении дают валидные результаты.
Мы стараемся использовать исследование цельного лоскута, но в следующих случаях лучше выполнить разделение на части:

Размер лоскута более 2 см в диаметре – срез всего лоскута не поместится на предметном стекле;
Сложная трехмерная конфигурация лоскута (при полнослойных резекциях крыла носа, ушной раковины, реснитчатого края века, содержащие в своем составе хрящ или тарзальную пластинку). В этом случае поверхность резекции часто состоит из перпендикулярно расположенных участков, а упругие ткани в толще лоскута препятствуют релаксации. Попытка привести эти участки в единую плоскость чревата неполным прилеганием участков к листу картона. В итоге, в срезе поверхности резекции будут «пробелы», надежность гистологической оценки радикальности удаления опухоли снизится.
Важно: при разделении материала на несколько частей – каждой части присваивается свой порядковый номер (пишем маркером рядом на листе картона, делаем фото). Все последующие пункты будут выполняться с каждой частью отдельно.

Крупный резецированный лоскут. Слева - удаленная центральная часть. Пронумерованы одинарные насечки.

Лоскут для исследования разделен: периферический край отделен от глубокого края и разделен по насечкам. Каждой части присвоен номер (от 1 до 8).

Глубокий край также разделен на части с присвоением порядкового номера (от 9 до 12).

Цветовая маркировка

Пока иссеченный лоскут лежит на листе картона, нам понятна его ориентация: в самом начале мы визуализировали насечки, нанесли в соответствии штрихи на картоне. Но затем нам предстоит перенести материал на металлический диск для заморозки, сделать срезы, и при оценке среза под микроскопом понимать, какой части раны соответствует тот или иной участок среза.
Очень удобным и надежным способом сохранить ориентацию лоскута и среза является цветовая маркировка. Оптимальным является использование маркировочных красителей двух-трех цветов. Краска наносится острой деревянной палочкой вдоль края эпидермиса. Для надежного сохранения красителя на материале рекомендуется перед нанесением предварительно встряхивать флакон с красителем.

Окраска единого лоскута 3-мя красителями:

Каждая часть разделенного лоскута окрашена 2-мя красителями (по полюсам). Для удобства смежные полюса соседних частей окрашены одним цветом:

Заморозка

Схематично это выглядит так: материал помещают в матричную среду и замораживают. Заботиться об ориентации на этом этапе уже не нужно, так как для этого уже нанесена краска. Но здесь есть очень важный технический момент: нужная нам глубокая поверхность и периферический край резекции после этапов денуклеации и релаксации располагаются в одной плоскости и плотно прилегают к листу картона. При заморозке мы возьмем материал с картона и переместим в место заморозки. И при этом важно сохранить эту единую плоскость, так как любые неровности будут приводить к появлению «белых пятен» на срезах, снижая надежность методики. Очень большое значение имеет качественное выполнение релаксации лоскута – чтобы лоскут «обмяк», и вся дерма периферического края резецированного лоскута без дополнительных усилий самопроизвольно прилегала к листу картона. Если в каком-либо месте дерма норовит приподняться над плоскостью картона и приходится прижимать ее насильно в этом месте – при перенесении на плоскость заморозки с высокой вероятностью это место вновь приподнимется, и мы получим пробел в этом месте.

Вид лоскута сбоку перед заморозкой. Достигнуто плотное прилегание на всем протяжении периферического края лоскута к листу картона:

Существует много вариантов технического исполнения данного этапа. Опишу лишь два, которые используем в своей практике:

1

Непосредственная заморозка на диске для образца. Предварительно на охлажденный диск наносим матричную среду для криотомии и помещаем в камеру криостата. Формируется плоская подушка. Далее вынимаем этот диск из камеры криостата, наносим сверху еще матричную среду. И сразу же в эту гелеобразную среду помещаем подготовленный материал нужной нам поверхностью резекции вверх. Расправляем материал, добиваясь ровной плоской поверхности. Далее помещаем диск с образцом в криокамеру на панель быстрой заморозки и сразу же, до застывания среды, сильно придавливаем металлической гирей быстрого охлаждения. В результате нужная нам поверхность резекции замораживается в виде единой плоскости.
Метод быстрый и простой, но подходит только для небольшого по размеру материала, с очень хорошей степенью релаксации.
2

Использование Криофиксатора (Cryoembedder). На сухой охлажденный диск Криофиксатора с листа картона переносим подготовленный материал поверхностью резекции вниз (к поверхности диска). И максимально быстро, пока не замерзли, поправляем края лоскута, контролируя примыкание к поверхности диска по всей окружности.

Лоскут перенесен на охлажденный диск Криофиксатора и заморожен. Видно полное примыкание периферического края резекции к плоскости диска:

После этого покрываем лоскут матричной средой. И вставляем диск в Криофиксатор, вместе с диском для образца с подушкой замерзшей матричной среды. Средами друг к другу. Плотно прижимаем и быстро замораживаем с использованием криоспрея.

Вид Криофиксатора с замороженным препаратом.

Для полного охлаждения помещаем Криофиксатор в камеру криостата. Извлекаем блок «диск Криофиксатора – диск для образца» и удаляем диск Криофиксатора (благодаря гладкой поверхности диска он легко смещается боковым усилием). И у нас остается диск для образца с замороженным на нем в матричной среде лоскутом и обращенной к нам поверхностью резекции.

Готовый к выполнению срезов замороженный препарат. Хорошо виден весь периферический край (дерма+эпидермис), глубокая поверхность резекции в центре также без пробелов.

Можно также увидеть насечки периферического края, цветовую маркировку края.
Криофиксатор помогает замораживать относительно крупные лоскуты, сохраняя расположение всей глубокой поверхности.

Если иссеченный лоскут на этапе релаксации был разделен на несколько частей, каждая часть замораживается отдельно. Чтобы впоследствии не перепутать, лучше на полке быстрого замораживания криостата пронумеровать пазы для дисков с образцами. И каждый диск помещать в паз с порядковым номером, соответствующим порядковому номеру, присвоенному замороженной на нем части материала.

Нумерация замороженных частей крупного лоскута - должна совпадать с нумерацией частей при разделении лоскута

Приготовление срезов

Существует несколько моментов, имеющих важное значение при выполнении свежезамороженных срезов для хирургии по Mohs:

1

Если мы посмотрим на препарат сразу после заморозки, то увидим перед собой приведенные в единую плоскость периферический край резекции и глубокую поверхность удаленного лоскута. Логично, что первый срез и был бы самым адекватным для оценки, выполнена ли резекция исключительно в пределах здоровых тканей или в каком-то месте прошла по опухоли.
Чисто технически, чтобы получить срез хорошего качества, предварительно выполняются «примерочные» срезы. При выполнении криозамороженных срезов тканевых биоптатов обычно это не является проблемой и никак не влияет на качество исследования. Но в случае Mohs-хирургии с каждым «примерочным» срезом мы удаляемся от истинной поверхности резекции и движемся в сторону опухоли. И, соответственно, повышаем вероятность ложно-положительного заключения гистологического этапа.
2

При удалении опухолей по методу Mohs мы используем небольшой первичный отступ, зная, что сразу после проверим гистологически всю поверхность резекции. Поэтому важно, чтобы вся плоскость глубокой поверхности и периферического края резекции была представлена на срезе в хорошем качестве. Любые дефекты, как подворачивание краев, сминание ткани, пробел вследствие неполного прилегания материала к единой плоскости, приводят к выпадению из оценки какой-то части края, повышая вероятность здесь уже ложно-отрицательного результата.

Суммируя оба этих момента, можно сказать, что целью является получение качественного среза «без пробелов» при минимальном количестве примерочных срезов.
Техническое исполнение: помещаем диск с замороженным материалом в патрон держателя криостата. Медленно приближаем материал к лезвию. Одновременно в ручном режиме ориентируем плоскость материала параллельно ходу лезвия. Препарат замораживался на плоскости диска криофиксатора либо на плоскости гири быстрого охлаждения. Поэтому обращенная к лезвию криотома поверхность представляет собой четкую ровную плоскость. И, ориентируя на глаз эту поверхность параллельно ходу лезвия, обычно через 3-7 примерочных срезов толщиной 8 микрон можем получить уже полный качественный срез всего замороженного круга.

Температура образца и толщина среза – важные параметры:

Недостаточное охлаждение образца приводит к «сминанию» тканей, а переохлаждение - срез начинает крошиться;
Чем тоньше срез – тем лучше качество микроскопического изображения.

Жировая ткань замерзает при более низких температурах, чем дерма или мышечная ткань. Поэтому:

Срезы образцов, содержащих дерму и мышечные волокна, но мало жировой ткани – при резекции опухолей кожи век, носа, губ, ушных раковин - мы выполняем при температуре 23-25°С и толщиной 8 мкм.
Срезы образцов, содержащих большое количество жировой ткани – при резекции опухолей кожи щек и лба – мы выполняем при температуре 30°С и толщиной 10-15 мкм.

Полезные советы:

если срез крошится – можно немного потереть поверхность образца пальцем в перчатке. Это согреет его и ломкость исчезнет;
если срез сминается – необходимо снизить температуру, и выждать время для достаточного охлаждения материала. Может помочь также охлаждение криоспреем или прикладывание к образцу гири быстрого охлаждения;
глубина выдвижения пластины, препятствующей скручиванию среза: край лезвия должен отсвечивать в виде тонкой сверкающей линии.

После получения хорошего качественного среза, касаемся его плоскостью покровного стекла – ткань моментально прилипает к стеклу. Стекло для фиксации материала помещаем в раствор формалина на 15 секунд – и далее выполняется окрашивание среза.
Предметные стекла обязательно подписать (лучше перед выполнением среза). Мы используем цифровой код: «*/*», где первая цифра – этап хирургической резекции опухоли (1- первичное удаление опухоли, 2,3 т.д. – повторные резекции при обнаружении опухоли в крае), вторая цифра – порядковый номер части препарата (присвоенный на этапе релаксации). Например, если иссеченный первичный лоскут небольшой, и мы не разделяли его на части – делаем только стекла 1/1. Если мы разделили его на этапе релаксации на 2 части, то присваиваем частям номера «1» и «2». Соответственно, делаем стекла 1/1 и 1/2. Если на первом этапе обнаружена опухоль в крае, мы резецировали участок раны 2-м этапом и заморозили единым материалом – нумерация стекол будет «2/1».

Окрашивание срезов

Мы выполняем окрашивание гематоксилин-эозином. Существуют автоматические устройства для окрашивания, однако вполне удобно окрашивать и ручным способом, используя небольшие емкости. Последовательность такая:

1

Промывание проточной водой 30 секунд;
2

Гематоксилин Джилла – 45-60 секунд;
3

Промывание проточной водой 60 секунд;
4

Замачивание в абсолютном спирте – 30 секунд;
5

Спиртовой эозин 10-15 секунд;
6

Промывание в абсолютном спирте 60 секунд.

Наносим на срез 2-3 капли монтирующего вещества, укладываем покровное стекло и плотно прижимаем. Стекло готово.

Макроскопический вид окрашенных срезов по Mohs:

Свяжитесь с нами любым удобным способом. Мы всегда рады новым идеям и ответим на ваши вопросы :

E-mail: hello@company.com
Телефон: +123 466 567 78
Соцсети: Facebook | Instagram | Youtube